不靠病毒潛入體內(nèi) “上帝的手術(shù)刀”更安全

在把CRISPR-Cas9送到細(xì)胞中時(shí),，需要借助載體的幫助,。其中病毒載體是目前最流行的遞送方式,，但其成本高,、存在脫靶效應(yīng),，還會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生致癌風(fēng)險(xiǎn),。而這次浙江大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)的最新成果,，為非病毒載體在基因編輯中的運(yùn)用打開(kāi)了另一扇窗,。

精確定位并切斷DNA上的基因位點(diǎn),，關(guān)閉某個(gè)基因或引入新的基因片段,，讓失去希望的病人重獲治愈的可能……CRISPR基因編輯技術(shù),，自問(wèn)世以來(lái)就被譽(yù)為“上帝的手術(shù)刀”。

但是,，這個(gè)神奇的“手術(shù)刀”居然也有失手的時(shí)候,，其脫靶效應(yīng)一直是阻礙其應(yīng)用的關(guān)鍵障礙之一。

近日,，由來(lái)自南京大學(xué),、廈門(mén)大學(xué)和南京工業(yè)大學(xué)的科研人員，開(kāi)發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型載體,，可實(shí)現(xiàn)基因編輯可控,，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前,，該成果已在新一期美國(guó)《科學(xué)進(jìn)展》雜志上發(fā)表,。

來(lái)自病毒載體的擔(dān)憂

轉(zhuǎn)基因大豆油、抗蟲(chóng)棉花,、甚至是免疫艾滋病的基因編輯嬰兒……雖然爭(zhēng)論不休,，但在短短數(shù)十年時(shí)間里，基因編輯技術(shù)作為一個(gè)新時(shí)代的產(chǎn)物,，還是迅速地跟多數(shù)普通人建立起聯(lián)系,。但是，說(shuō)到其中運(yùn)用的工具和原理,，很多人就不太熟悉了,。

自上世紀(jì)60年代揭示遺傳密碼的秘密之后，人類對(duì)基因的改造嘗試就從未停止過(guò),。用更形象的說(shuō)法,，基因編輯可以理解為，利用“基因剪刀”將DNA鏈條斷開(kāi),，對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行改造的過(guò)程,，無(wú)論是增添還是敲除基因，本質(zhì)上都是從分子水平改變生物的性狀,。

目前,，科學(xué)家們最普遍使用的“基因剪刀”是一種名為CRISPR-Cas9的外源DNA，它的誕生離不開(kāi)細(xì)菌,。病毒為了自身繁衍利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù),，細(xì)菌在與病毒抗?fàn)幍倪^(guò)程中，在體內(nèi)進(jìn)化出CRISPR系統(tǒng),，能夠不露聲色地將病毒基因從自己的染色體上切除,。科學(xué)家們正是利用了這一特性,，開(kāi)發(fā)出了這款尖端的“基因剪刀”,。

如何把CRISPR-Cas9送到細(xì)胞中去,？這就需要借助到載體的幫助。

根據(jù)基因載體來(lái)源,，我們可以把基因載體分成5大類,，分別是質(zhì)粒載體、噬菌體載體,、病毒載體,、非病毒載體和微環(huán)DNA。其中病毒載體是目前最流行的遞送方式,，截至2018年6月,，臨床試驗(yàn)中超過(guò)70%的基因藥物載體為病毒。將復(fù)合物連接到病毒后,，病毒侵入靶細(xì)胞的細(xì)胞核,，CRISPR-Cas9這把“基因剪刀”才能發(fā)揮出真正的功能。

逆轉(zhuǎn)錄病毒,、腺病毒和腺相關(guān)病毒(AAV),，這三大類病毒，已經(jīng)在提供遺傳物質(zhì)的治療方面進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用,。然而,，構(gòu)建病毒載體是一個(gè)艱苦而且高成本的過(guò)程，并且運(yùn)用這些病毒載體遞送并不能做到萬(wàn)無(wú)一失,?！癈RISPR-Cas9的優(yōu)勢(shì)很明顯，劣勢(shì)也明顯,。它存在脫靶效應(yīng),，也可能會(huì)切斷目標(biāo)之外的其他區(qū)域，對(duì)正常的區(qū)域進(jìn)行切除時(shí),，就會(huì)產(chǎn)生很大的損傷,。”南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院教授宋玉君說(shuō),。

研究表明,，病毒類載體在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中存在著固有缺點(diǎn)，包括致癌風(fēng)險(xiǎn),，插入大小限制以及會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng),。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒可能造成插入性突變,，導(dǎo)致癌癥發(fā)生,，向靜脈高劑量注射AAV用于基因治療也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重毒性。

更安全的基因編輯載體來(lái)了

病毒作為運(yùn)輸載體用于基因工程的安全性還不能完全掌控,，因此科學(xué)家們提出了幾種替代的非病毒遞送材料,，包括金納米顆粒、黑磷,、金屬有機(jī)骨架,、氧化石墨烯和各種納米材料。

相比病毒,，這些材料在安全性上有了很大的提升,。但是，基因編輯的時(shí)間和基因編輯的

過(guò)程,，仍然無(wú)法為科學(xué)家所控制,。

發(fā)表在《科學(xué)進(jìn)展》雜志上的最新科研成果中，來(lái)自南京大學(xué),、廈門(mén)大學(xué)和南京工業(yè)大學(xué)的科研人員開(kāi)發(fā)出一種“基因剪刀”工具的新型非病毒載體,，可以通過(guò)近紅外光控制“修剪”基因的方式，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)時(shí)間和空間上的基因編輯可控,，在癌癥等重大疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景,。

針對(duì)CRISPR-Cas9的脫靶效應(yīng)，研發(fā)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)一年半的試驗(yàn),，研發(fā)出一種名叫“上轉(zhuǎn)換納米粒子”的非病毒載體,，這種納米粒子可以被細(xì)胞大量?jī)?nèi)吞，通過(guò)一種光敏化合物將CRISPR-Cas9鎖定在上轉(zhuǎn)換納米粒子上,。

宋玉君表示：“紅外光具有強(qiáng)大的組織穿透性,，這為在人體深層組織中安全、精準(zhǔn)地應(yīng)用基因編輯技術(shù)提供了可能,?！?/p>

實(shí)驗(yàn)的觸發(fā)裝置就在于兩種光——近紅外光和紫外光。近紅外光和紫外光具有特殊的性質(zhì),，前者可以穿透人體組織到達(dá)目標(biāo)位置,，后者則可以實(shí)現(xiàn)切斷光敏分子。暴露在近紅外光下,，這些納米粒子吸收低能近紅外輻射并將其轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)的紫外光,，能夠自動(dòng)打開(kāi)納米粒子和Cas9蛋白之間的“鎖”，使Cas9蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶點(diǎn)基因精準(zhǔn)敲除,，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。

該團(tuán)隊(duì)從基因,、蛋白及細(xì)胞等多個(gè)角度對(duì)該體系的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證,，在對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療的過(guò)程中團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，只有近紅外光照射實(shí)驗(yàn)組的腫瘤得到了有效抑制,，且從20天后取下的腫瘤大小來(lái)看,，實(shí)驗(yàn)組腫瘤遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組,。

該技術(shù)為非病毒載體在基因工程上的運(yùn)用打開(kāi)了另一扇門(mén)。一旦未來(lái)這項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)臨床,，腫瘤尤其是實(shí)體瘤就能實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)治療,，帕金森癥、糖尿病等患者也能從這項(xiàng)技術(shù)中受益,。

非病毒載體未來(lái)無(wú)可限量

病毒載體雖然在臨床中廣泛使用,，但其安全不確定性、高昂的制備及運(yùn)輸費(fèi)用制約著其在基因工程中的推廣前進(jìn),。因此,，非病毒載體越來(lái)越引起研究者的注意。

“目前,，各種納米材料的非病毒載體都有科研人員在做,，比如可降解的生物高分子材料，它的前景是非常大的,?！彼斡窬嬖V記者。

關(guān)于非病毒載體的研究有兩個(gè)方向,，一個(gè)是有機(jī)材料基因遞送體系,，另一個(gè)是無(wú)極材料基因遞送體系。在有機(jī)材料研究領(lǐng)域中,，脂質(zhì)體,、聚乙烯亞胺及其衍生物、陽(yáng)離子多肽,、樹(shù)形分子及其衍生物,、殼聚糖及其衍生物、聚氨基酯,、環(huán)糊精及其衍生物為科學(xué)家研究的主要方向,。

各類脂質(zhì)體設(shè)計(jì)的非病毒脂質(zhì)納米粒子易于制備，免疫反應(yīng)不劇烈,，而且有更大的有效荷載,，因此已經(jīng)在臨床中被廣泛運(yùn)用，如疫苗和基因藥物遞送,、癌癥治療,、腫瘤影像學(xué)等都會(huì)使用這種遞質(zhì)。以聚乙烯亞胺及其衍生物為載體的遞送系統(tǒng)也已經(jīng)運(yùn)用在多重疾病的臨床試驗(yàn)中,，包括卵巢癌,、胰腺癌、原發(fā)性腹膜惡性腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤等,。而其他的遞質(zhì)材料的研究基本沒(méi)有進(jìn)入臨床階段,。

相比于有機(jī)材料，無(wú)機(jī)材料則更容易人為控制,，它的尺寸可調(diào),，表面也容易修飾。金納米粒,、碳納米管、石墨烯,、上轉(zhuǎn)換納米粒等材料均有廣泛研究,，主流的遞送方式包括將負(fù)電基因與正電無(wú)機(jī)納米粒形成復(fù)合物、將基因以響應(yīng)性共價(jià)鍵形式連接在納米粒上或者在無(wú)機(jī)納米粒表面修飾兩親性高分子,，負(fù)電荷基因通過(guò)靜電作用吸附在高分子層中,。宋玉君所在團(tuán)隊(duì)研發(fā)的光操縱基因編輯新技術(shù)還是第一次。

目前,，無(wú)機(jī)遞送材料的研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段,，臨床階段的試驗(yàn)尚未批準(zhǔn)，關(guān)于它對(duì)機(jī)體的影響還沒(méi)有確切的定論,。

“無(wú)機(jī)納米粒子含有人體非必須的元素,，因此可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)時(shí),，對(duì)小鼠層面觀察時(shí)間比較短,，少至幾周多則幾個(gè)月，在細(xì)胞層面和動(dòng)物層面還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大的影響,。如果能夠找到合適,、安全、具有相同功能的無(wú)機(jī)材料,，它的前景將會(huì)無(wú)可限量,。”宋玉君對(duì)非病毒載體的未來(lái)充滿信心,。